chip实验（chip实验及结果分析求助）

本文目录

• chip实验及结果分析求助
• Chip实验需要在生物安全柜做吗
• 拟南芥chip实验超声后为什么跑胶有rna污染
• 什么是染色质免疫共沉淀技术（ChIP）
• chip实验中该用proteinA还是proteinG
• chip实验原理及步骤

chip实验及结果分析求助

如Co-IP
用抗体A进行IP，然后常规是WB检测与A相互作用的B、C、D。。。蛋白
这些蛋白都是预测（或者说是已经有研究表明有相互作用的蛋白）
ChIP也基本上差不多，设计预测的一些引物，或者ChIP on Chip，sequence等

Chip实验需要在生物安全柜做吗

需要在安全柜做。
Chip实验有很多细胞，生物试验中只涉及微生物样品，可以使用基本类型的生物安全柜，如果生物试验中涉及了微生物样品和微量化学试剂（非腐蚀性），使用装备外排管道的安全柜是必要的。
因为HEPA过滤器并不能有效过滤清除化学气体，如果不能外排，将对实验室内工作人员和环境造成威胁。所以chip实验还是需要在生物安全柜下进行。

拟南芥chip实验超声后为什么跑胶有rna污染

RNA的抽提关键是每一步操作要细心. 所用TIP头, EP管等都要经DEPC处理, 水要用RNASE-FREE水, 防止无所不在的RNA酶污染,即便是DEPC处理后如果操作过程不注意的话,仍然会污染. Trizol 一般不会有问题的, 估计还是操作的问题.

什么是染色质免疫共沉淀技术（ChIP）

染色质免疫共沉淀技术是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来的技术。

这项技术主要用来分析目标基因有没有活性、或者分析一种已知蛋白（转录因子）的靶基因有哪些。该技术主要应用于以下几方面：

1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

2.转录调控分析

3.药物开发研究

4.有丝分裂研究

5.DNA损失与凋亡分析

扩展资料：

实验步骤：

1、细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。

值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2、染色质断裂

交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。

所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

技术应用：

1、Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。

因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。

2、染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的，可采用狭缝杂交（Slot blot）的方法，把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交，来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。

还可以根据靶序列设计引物，用半定量PCR的方法进行测定，或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少，所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针，再进行整个基因组扫描。

还可以把沉淀的DNA克隆到载体中，进行测序，寻找该序列附近的开放阅读框，发现新的基因调节序列。

3、目前，随着人类基因组测序工作的基本完成，研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大，上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片（chip）技术与染色质免疫沉淀技术（ChIP）相结合，为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。

ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段，和另一个被标记不同探针的对照组样品一起，与DNA芯片杂交，再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析，具体的实验步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。

ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络，染色质修饰机制在基因组中的调控，DNA的复制，修复以及修饰，基因的转录与核运输等诸多方面。

4、染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。

值得注意的是，因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少，所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。

5、随着染色质免疫沉淀技术受到广泛的关注，运用该技术发表的文章也逐渐增多，大家越来越多的开始关注如何改进ChIP的方法。Millipore最新推出的Magna ChIP试剂盒，利用磁珠分离DNA-蛋白-抗体复合物，提高了ChIP的效率，简化了操作的过程，缩短了实验的时间，还为同时进行多个目的蛋白的研究提供了可能，是经常使用ChIP技术的研究人员的理想选择。

6、近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用，其原理与DNA类似，也包括甲醛固定，超声波破细胞，免疫沉淀，交联逆转，RNA纯化和RNA鉴定等步骤。所不同的是，交联逆转只用Proteinase K，要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理，分析时用RT-PCR，芯片杂交要用cDNA芯片等。

参考资料：百度百科-染色质免疫共沉淀

chip实验中该用proteinA还是proteinG

染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。
它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。

chip实验原理及步骤

• chip实验原理
  在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

chip实验步骤具体如下：
第一天：
(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出 1 平皿细胞( 10cm 平皿)，加入 243ul 37 %甲醛，使得甲醛的终浓度为 1%。(培养基共有 9ml )
2、37 摄氏度孵育 10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125M 。450ul 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置 5min 即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。
5、细胞刮刀收集细胞于 15ml 离心管中(PBS 依次为 5ml ，3ml 和 3ml )。预冷后 2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer 。使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106 个细胞。这样每 100ul 溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 长满板为 5×106 个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4×106 个细胞。因此每管 加 入 400ul SDS Lysis Buffer 。将 2 管混在一起，共 800ul 。
7、超声破碎： VCX750 ， 25%功率， 4.5S 冲击， 9S 间隙。共 14 次。当然，如果实验室有Bioruptor 这种神器的话那就轻松了。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后， 10， 000g 4 度离心 10min 。去除不溶物质。留取 300ul 做实验，其余保存于-80 度。300ul 中， 100ul 加抗体做为实验组; 100ul 不加抗体做为对照组; 100ul 加 入 4ul 5M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2M )， 65 度处理 3h 解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在 100ul 的超声破碎产物中，加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转混匀 1h。
10、 1h 后，在 4 度静置 10min 沉淀， 700rpm 离心 1min 。
11、取上清。各留取 20ul 做为 input 。一管中加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体。 4 度颠转过夜。
(三)、检验超声破碎的效果。
取 100ul 超声破碎后产物，加入 4ul 5M NaCl ， 65 度处理 2h 解交联。分出一半用酚 /氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转 2h。
13、 4 度静置 10min 后， 700rpm 离心 1min 。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在 4 度颠转 10min ，4 度静置 10min 沉淀， 700rpm 离心 1min ，除去上清。
洗涤溶液： a. low salt wash buffer----one wash
b. high salt wash buffer-----one wash
c. LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方： 100ul 10 % SDS， 100ul 1M NaHCO3 ， 800ul ddH2O ，共 1ml 。每管加入 250ul 洗脱 buffer ，室温下颠转 15min ，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。终的洗脱液为每管 500ul 。
16、解交联：每管中加入 20ul 5M NaCl (NaCl 终 浓 度为 0.2M )。混匀，65 度解交联过夜。

第三天：

(一)、DNA 样品的回收
17、解交联结束后，每管加入 1ul RNaseA ( MBI )， 37 度孵育 1h。
18、每管加入 10ul 0.5M EDTA ， 20ul 1M Tris.HCl ( PH 6.5)， 2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45 度处理 2h。
19、 DNA 片段的回收 ――― omega胶回收试剂盒。终的样品溶于 100ul ddH2O 。
(二)、PCR 分析
ChIP 技术总结
(一)关于细胞
细胞的生长状态要好。 因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络， 也很有
可能影响你所研究的 TF 与其靶 Promoter 的结合。一般细胞长到 75%- 80%比较好。
(二)关于抗体
抗体是实验成败的致命因素之一!必须是 IP 级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和 santa cruz 的抗体，即使是 IP 级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。 两种抗体各有利弊。 单抗特异性强，背景低。 但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在 ChIP 甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭， 导致单抗不能识别靶蛋白。 多抗虽然没有这个问题， 但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域) ，选择多抗比较稳妥一些。
(三)关于交联与超声破碎

这一块的确是 ChIP 实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白与其 Promoter 相结合，富集得到的 Promoter 的量不高，实验假阴性。 交联过充分， 基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。
一般来讲，按照经验，交联条件取决于细胞类型。 不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如： NIH - 3T3 的交联条件是室温( 25 摄氏度)下 15min ， 1%的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor 这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是 200bp- 1000bp。但是 200bp- 2000bp 的范围也是可以接受的。
(四)关于操作
希望尽可能的保持低温( 4 度)。沉淀的时候可以先在 4 度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速( 500rpm 等)离心使其完全沉降。虽然说明书上说 ChIP 实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到 PCR 结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
　(五)关于解交联
虽然说明书上说 4 小时已经足够， 但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA 不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在 EP 管口封上封口膜。
(六)关于 DNA 片段的回收

需要注意的是：样品中 SDS 样品较高，普通的 PCR 产物回收试剂盒回收，很有可能会在终的样品中混入 SDS，影响 PCR 实验结果。小 Tip ：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除 SDS 沉淀。