western blot实验步骤（求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol）

本文目录

• 求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol
• 求胃癌细胞的western blot步骤，可以直接写在小论文上发表的简洁版
• western blotting 的过程和原理
• 免疫组化和 western blot 有什么区别
• Western blot实验需要准备什么试剂和耗材
• westernblot的原理及操作步骤，应用有哪些
• Western Blotting的实验原理和实验步骤，它和ELISA的区别在蛋白质测定上什么情况选用什么方法
• western blot 步骤是什么

求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol

我个人经验，也以六孔板为例：
1、移除旧培养液
2、每孔加PBS1ml，漂洗1到2次
3、每孔加蛋白裂解液100ul（蛋白裂解液不易加多，多了会稀释蛋白浓度）
4、然后用细胞刮棒来回刮除细胞，用枪头吸出液体至干净的EP管（操作最好在冰上，尽量吸干净）
5、短暂振荡一下，置冰静置15到30分钟
6、离心：12000转，20min。离心结束后你会看到管底有沉淀
7、将上清液移至新的EP管，注意不要碰到沉淀，取10ul留作后来蛋白定量，剩下的记下转移量
8、我们实验室用5X上样缓冲液按1:4的体积加入，比如你上面的转移量是80微升，那么就加入5X上样缓冲液20微升。
9、短暂振荡，离心
10、煮蛋白，就是沸水5分钟
11、最后-80度保存就可以了
我自己就这样，呵呵，其实很简单

求胃癌细胞的western blot步骤，可以直接写在小论文上发表的简洁版

一.实验步骤
1. 组织块称重
2. 利用液氮、研钵粉碎组织块
3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃
4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟
5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟
6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度
8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液
9. 沸水浴中3分钟
10. 上样
11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）
13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色
14. Westernblot 试剂盒显色
15. 分析比较记录
western blot的实验步骤及注意事项的资料
1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）
9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。
11．按步骤9洗涤。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。
注意事项：
western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白.
(3) 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。
用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。
回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

western blotting 的过程和原理

什么理论过程？就是原理呗？
WesternBlot原理、显色分类及操作步骤
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
二、操作步骤：
(一)配胶
1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
2、封胶：
灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
3、灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)
(二)样品处理
1．培养的细胞（定性）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。
⑶100℃，1min。
⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。
⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
⑹待样品恢复到室温后上样。
2．培养的细胞（定量）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：
⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM
由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。
1×loadingbuffer配方：10%甘油，50mMTris•Cl(pH6.8)，2%β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。
对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。)
(三)电泳
1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。
2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
电泳液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,0.1%SDS（10ml10%SDS）/L
Tris-base1.5g,glycine7.2g,0.1%SDS（5ml10%SDS）/0.5L
(四)转膜
1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：
将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）
3．转膜：
湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
电转液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L
(五)封闭及杂交
1．封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2．结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3．洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
PBST：1×PBSTTBS：Tris-HCl20mM,pH7.4(25℃)
Tween-200.01%~0.02%NaCl150mM
Tween-200.05%
封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200mlPBST或TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。
(六)发光鉴定
一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
1．HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2．AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。
三、注意事项：
增强敏感性
若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：
用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。
将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。
封闭40~60min
一抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。
PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
二抗杂交，37℃1h。
PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
发光鉴定。
若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
10．三抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
12．发光鉴定。
一抗溶液中加入0.2%叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）
(七)NC膜的多次使用
一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。
如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。
如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

免疫组化和 western blot 有什么区别

1、原理不同：

免疫组化利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。

western blot也是利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应。

2、组织定位不同：

免疫组化在组织定位和定性上比较准确，但是在定量上不够准确。western blot因为有内参标定，所以在定量上要更加准确，但是在组织定位上不如免疫组化。

扩展资料：

一、 免疫组化（SP法）操作步骤：

1、切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行。

2、缓冲液洗 3min／2 次。

3、为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10－15 分钟。

4、缓冲液洗 5min／2 次。

5、滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

6、缓冲液洗 5min／2 次。

7、滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。

8、缓冲液洗 5min／2 次。

9、 滴加 Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育 20 分钟。

10、缓冲液洗 5min／2 次。

11、滴加 HRP Polymer（酶标二抗） ，在室温下孵育 30 分钟。

12、缓冲液洗 5min／2 次。

13、向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1－2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。

14、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

二、 western blot操作步骤：

1、SDS－PAGE试剂：见电泳实验。

2、匀浆缓冲液：1．0M Tris－HCl（pH 6．8）1．0ml；10％SDS 6．0ml；β－巯基乙醇 0．2ml；ddH2O 2．8ml。

3、转膜缓冲液：甘氨酸 2．9g；Tris 5．8g；SDS 0．37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、0．01M PBS（pH7．4）：NaCl 8．0g；KCl 0．2g；Na2HPO4 1．44g；KH2PO4 0．24g；加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考马斯亮兰 0．2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5％脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1．0g 溶于20ml的0．01M PBS中。

6、显色液：DAB 6．0mg；0．01M PBS 10．0ml；硫酸镍胺 0．1ml；H202 1．0μl。

Western blot实验需要准备什么试剂和耗材

1.1细胞
①将细胞培养皿置于冰上，用冰冷得PBS洗涤细胞2次
②吸出PBS，加入裂解液（碧云天P0013；1%TritonX-100；）
a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。
b.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。（一般10*7个细胞用100ul裂解后获得的上清蛋白浓度约为2-4mg/ml）
③用刮刀刮下贴壁细胞，转移至EP管，14000rpm离心5分钟
④将上清液转移至EP管，负20℃保存
1.2组织
①将组织样品剪成细小碎片（最好在冰上进行）
②加入裂解液
a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。
c.按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
d.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。如果组织样品本身细小，可适当剪切后直接加入裂解液，通过强烈涡旋使样品裂解充分
（每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同）
③充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清
2. 蛋白定量（Thermo UF289356)
2.1稀释白蛋白(BSA)标准液的制备
2.2 制备BCA工作液（A液：B液=50：1 密闭室温可以保存一段时间）
总体积=（#标准孔+#未知孔）*#复孔*每个样本的体积
测试管每管2ml;96孔板每孔200ul。
2.3 浓度测定
①将25ul标准液和样本设置复孔加入96孔板，按照样本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液(如果样本有限就加10ul比例用1：20；推荐每个待测的样本做2-3个平行反应；根据样品的浓度，可提前稀释5-10倍)
②最好摇匀30秒，将96孔板在37℃孵育30min
③冷却至室温，酶标仪设置为562nm，在5分钟内测试完所有的样本。
④所有的样本减去空白对照在562nm处的吸光度，绘制标准曲线，确定样本的浓度
3. 蛋白电泳
3.1 变性以及还原蛋白
在蛋白样品中加入含SDS（保证样品中的所有蛋白带电荷一致）的上样缓冲液，100℃加热煮沸。
3.1.1室温溶解蛋白上样缓冲液（5×），按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合。
3.1.2 100℃或沸水浴加热10分钟，以充分变性蛋白
3.1.3 冰上骤冷，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔即可
3.1.4通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近则可以停止电泳
4. SDS-PAGE凝胶电泳
4.1 胶的选择与制备（根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶的浓度）
4.2 配胶（碧云天P0012AC）
洗干净玻璃板，装板加水验漏后，晾干装到制胶架上。根据配方配胶。
（配胶顺序：先配分离胶（下层胶），充分凝固后，再配浓缩胶（上层胶））
4.2.2 配制浓缩胶（上层胶）
4.2.3 组装制胶器
①将制备好的分离胶灌入制胶板内（缓慢不要有气泡），随后缓慢加入适量异丙醇压平分离胶。
②20-30分钟分离胶凝聚完成，倾斜板，倒掉异丙醇，吸水纸吸去残余液体，弃去上层压胶的水或醇。
③加入配好的浓缩胶灌入制胶板内，然后插上梳子，20-30分钟浓缩胶即可凝聚。
④缓慢取出梳子，上样。
4.2.4 上样及电泳
①蛋白冰上溶解，调整蛋白浓度，和等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。用纯水冲洗胶板，放入电泳槽
②两块板之间倒入电泳液，确认无漏液
③迅速拔出梳子，用枪轻轻吹孔使碎片冲出
④依次加入蛋白marker和蛋白样品，每孔加上样液20ug，留一孔加预染的marker.加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70V恒压电泳，约30min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用90V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。（上样时间尽量短，避免样品扩散，但也不能过快避免样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染，未加样的孔中加入等量的样品缓冲液）
⑤调节电泳的电压和时间，传统胶是上层胶80V，30min;下层胶120V 90-120min.
(为了防止蛋白条带再凝胶上扩散，电泳后应尽快转膜)
5. 转膜
将蛋白凝胶中的蛋白，通过电流作用转移到转印膜上。由于蛋白凝胶本身易碎，蛋白条带容易子啊凝胶中扩散，而且抗体也不易于进入凝胶中与目的蛋白结合，所以需要在转印膜这样的固相载体上实现后续封闭、洗涤，显色等实验操作。
5.1 转膜
①将减好的PVDF膜用无水甲醇润湿30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作
②装配转膜三明治结构（在转移缓冲液中制备三明治可以避免气泡的产生）
黑面（负极）→海绵垫→3层滤纸→凝胶→转印膜→3层滤纸→海绵垫→红面（正极），每层之间不能有气泡。然后将三明治转移至电泳槽中，黑面对黑面。

westernblot的原理及操作步骤，应用有哪些

原理
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达.
分类
Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL.只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带.
其他
值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了.

Western Blotting的实验原理和实验步骤，它和ELISA的区别在蛋白质测定上什么情况选用什么方法

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法，建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术，是一种用酶标记抗原或抗体的方法。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来。
ELISA试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来，可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
ELISA基本原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
ELISA基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，基本原理有三条：
（1） 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
（2） 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3） 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。
　　免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。

western blot 步骤是什么

(PS
楼主可以百度嘛，网上关于WB的实验太多了)
Western免疫印迹（Western
Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western
Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、试剂准备
1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。
2、匀浆缓冲液：1.0M
Tris-HCl(pH
6.8)1.Oml；10%SDS
6.0ml；β-巯基乙醇
0.2ml；ddH2O
2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸
2.9g；Tris
5.8g；SDS
0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M
PBS(pH7.4)：NaCl
8.0g；KCl
0.2g；Na2HPO4
1.44g；KH2PO4
0.24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰
0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118
ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g
溶于20ml的0.01M
PBS中。
6、显色液：DAB
6.0mg；0.01M
PBS
10.0ml；硫酸镍胺
0.1ml；H202
1.0μl。
三、操作步骤
（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
（三）转移：（半干式转移）
1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
（四）免疫反应：
1、用0.01M
PBS洗膜，5min
×3次。
2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。
3、弃包被液，用0.01M
PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M
PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃
放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
5、弃一抗和1%BSA，用0.01M
PBS分别洗膜，5min×4次。
6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M
PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。
7、弃二抗，用0.01M
PBS洗膜，5min×4次。
8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
四、注意事项
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。
3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细